工作學(xué)習(xí)中一定要善始善終，只有總結(jié)才標(biāo)志工作階段性完成或者徹底的終止。通過總結(jié)對工作學(xué)習(xí)進(jìn)行回顧和分析，從中找出經(jīng)驗和教訓(xùn)，引出規(guī)律性認(rèn)識，以指導(dǎo)今后工作和實踐活動。那關(guān)于總結(jié)格式是怎樣的呢？而個人總結(jié)又該怎么寫呢？以下是小編為大家收集的總結(jié)范文，僅供參考，大家一起來看看吧。

pcr室年終總結(jié)篇一

班》心得

本人于2015年3月10至15日參加了廣東省臨檢中心舉辦的臨床基因擴(kuò)增實驗室技術(shù)人員上崗培訓(xùn)班。通過學(xué)習(xí)，除了取得廣東省臨檢中心頒發(fā)的培訓(xùn)證書外，還極大的提高了理論和實驗操作水平，現(xiàn)總結(jié)如下。

此次培訓(xùn)包括理論培訓(xùn)和實驗操作。在理論培訓(xùn)課程當(dāng)中，衛(wèi)生部臨床檢驗中心的李金明教授為我們詳細(xì)講解了《臨床基因擴(kuò)增實驗室設(shè)計及質(zhì)量管理體系的建立》、《臨床基因擴(kuò)增檢驗的質(zhì)量保證》等內(nèi)容。通過學(xué)習(xí)，了解到臨床pcr實驗室設(shè)計必須遵循各區(qū)獨立、注意風(fēng)向、因地制宜，方便工作的原則。質(zhì)量管理的內(nèi)涵：寫你所做的，做你所寫的，記錄你已做的，分析你已做的。認(rèn)識到臨床標(biāo)本的正確采集、運送、保存的重要性，是臨床檢驗的質(zhì)量保證的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，是解決涉及實驗室檢驗的醫(yī)患糾紛的方法之一。同時通過病例分析，對于臨床基因擴(kuò)增檢驗的檢驗前，檢驗中，檢驗后的質(zhì)量控制，還有實驗的結(jié)果處理和分析有了重新認(rèn)識。對于實驗室是否出現(xiàn)污染的鑒別，以及出現(xiàn)污染的處理措施有了深刻了解。

臨床實驗醫(yī)學(xué)的發(fā)展現(xiàn)在經(jīng)歷了三個時代，分別是生化診斷時代，免疫診斷時代，和和現(xiàn)在的分子（基因）診斷時代，而現(xiàn)今時代的標(biāo)志性技術(shù)正是pcr技術(shù)，是反映疾病本質(zhì)的實驗。正是有臨床基因擴(kuò)增檢驗技術(shù)在癌癥等疾病的診斷方面有了多方應(yīng)用，通過驅(qū)動基因的選擇，為靶向治療患者延長了生存期。為個體化診療中對疾病的鑒別診斷，診治方案的設(shè)定提供重要的參考依據(jù)，同時也為治療過程中臨床對于治療方案的調(diào)整提供依據(jù)。臨床基因擴(kuò)增檢驗技術(shù)在個體化診療中是不可或缺的一部分，是其重要的組成部分，具有強(qiáng)大的發(fā)展?jié)摿颓熬啊?/p>

實驗操作內(nèi)容為egfr突變基因檢測。實驗操作過程中，通過認(rèn)真學(xué)習(xí)和細(xì)致聽講帶教老師的規(guī)范實驗操作，了解到了實驗的關(guān)鍵操作，糾正了平常在臨床實際工作操作上的一些不良習(xí)慣，為日后規(guī)范檢驗操作提供了基礎(chǔ)。通過分組親自操做實驗，分析和判斷自己的實驗結(jié)果，做實驗記錄筆記，基本掌握egfr突變基因檢測。

通過為期六天的理論和實驗培訓(xùn)，從中學(xué)習(xí)到了很多知識，掌握了嚴(yán)格的防污染以及污染的處理措施，了解到實驗室設(shè)置的人流、物流、氣流的走向設(shè)計原則，解決了日常工作中的實際問題，為日后臨床基因擴(kuò)增檢驗工作的開展打下了堅實的基礎(chǔ)。了解到臨床基因擴(kuò)增檢驗技術(shù)的發(fā)展方向，受益匪淺。

pcr室年終總結(jié)篇二

pcr經(jīng)驗總結(jié)

s design

這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件

a 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當(dāng)然不是說越長越好,太長的引物同樣會降低特異性,并且降低產(chǎn)量。

b gc% 40%-60% c 5'端和中間序列要多gc,以增加穩(wěn)定性

d 避免3'端gc rich, 最后3個base不要有g(shù)c,或者最后5個有3個不要是gc e.避免3'端的互補(bǔ), 否則容易造成dimer f.避免3'端的錯配

g.避免內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)

h.附加序列(rt site, promoter sequence)加到5'端, 在算tm值時不需要加上這些序列,但在檢測互補(bǔ) 和二級結(jié)構(gòu)是要加上它們

i.需要使用兼并引物時, 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用較高的引物濃度(1um-3um)j.最好學(xué)會使用一種design 5,oligo6,dnastar, vector nti, online desgin et al.* 引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（tm）。這是當(dāng)50％對于設(shè)定pcr退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的 tm低5℃。

設(shè)定tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。有的是根據(jù)gc含量估算tm。確定引物tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計算機(jī)程序使用近鄰分析法。

根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的tm值，所有退火溫度只是一個起始點?？梢酝ㄟ^分析幾個逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。

為獲得最佳結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的tm值。引物對的tm差異如果超過5℃，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的tm低5℃或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高tm設(shè)計的退火溫度先進(jìn)行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低tm設(shè)計的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。ity of primers

定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對于大多數(shù)pcr應(yīng)用是足夠的。引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。最好在te重溶引物，使其最終濃度為100μm。te比去離子水好，因為水的ph經(jīng)常偏酸，會引起寡核苷的水解。引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μm濃度溶于te的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存 2個月。ze reactants concentration iom ions mg離子的作用主要是 dntp-mg 與核酸骨架相互作用，并能影響polymerase的活性。一般 的情況下 mg的濃度在0.5-5mm之間調(diào)整。同樣要記住的是在調(diào)整了dntps的濃度后要相應(yīng)的調(diào)整mg離子的濃度。對實時定量pcr，使用3-5mm帶有熒光探針的鎂離子溶液。

b.其他的離子

nh4+ k+都會影響pcr。增加k+的濃度后, 會因為中和了核酸骨架上磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷而影響退火的溫度,從而降低了pcr的 嚴(yán)謹(jǐn)性(stringency).nh4+公司的taq酶就提供了兩種buffer, 一種是加mg的一種是已經(jīng)混合了(nh4)2so4的.當(dāng)然, 過高的陽離子濃度(kcl>0.2m)時, dna在94度根本不會發(fā)生變性, rase 不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度。一些高保真酶的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些.另外, 一般的 情況下, 變性的溫度可以使用90~92度, 變性的時間也可以縮短,從而保證polymerase的活性 te 50ul pcr system human gdna 0.1ug-1ug 10ng-100ng lamada dna 0.5ng-5ng plasmid dna 0.1ng-10ng ature ration 常規(guī)是94度5分鐘, gc rich的摸板是95度5分鐘，除了gc rich外, 常規(guī)的applications可以將這部分時間縮短到1到2分鐘, 或者在cycle 1時給予較長的時間,而取消開始的denaturation ing 重點到了。一般情況下, 是從55度開始.根據(jù)情況配合以mg離子濃度進(jìn)行調(diào)整.有條件的可以做gradient pcr.退火的時間在30-60s, 時間短一些可以得到更好的效果.因為, polymerase 在annealing temp.時也會有一些活性.所以在a.t.的時間過長, 會極大的增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險.另外,在對于一些困難戶, 比如從gdna里擴(kuò)增大片段, 還可使用two step own pcr

原理很簡單,但的確是一個很有用的方法。舉個例子就ok, annealing temp.55度 94 5min—（94 30s—60 30s—72 1min）×2—（94 30s—59 30s—72 1min）×2—（94 30s—58 30s—72 1min）×2—........—（94 30s—51 30s—72 1min）×2—（94 30s—50 30s—72 1min）×20—72 5min

start pcr

熱啟動pcr是除了好的引物設(shè)計之外，提高pcr特異性最重要的方法之一。盡管taq dna聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行pcr反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于dna工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動pcr尤為有效。限制taq dna聚合酶活性的常用方法是在冰上配制pcr反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的pcr儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。

熱啟動通過抑制一種基本成分延遲dna合成，直到pcr儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入taq dna聚合酶，在反應(yīng)體系達(dá)到90度時，pause，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這個方法 過于煩瑣，尤其是對高通量應(yīng)用，并容易造成污染。其他的熱啟動方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，加入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。

ampliwax pcr gems(perkin elmer)taq bead hot start polymerase(promega)magnesium wax beads(stratagene).象手動熱啟動方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。還有一種方法是使用inactive dna rase被抗體抑制失活，當(dāng)變性溫度超過70度時，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。

r pcr

我們知道1ug human genomic dna 大約在3x105個模板分子,這樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結(jié)合.當(dāng)模板的濃度過低,比如低于100個分子時, 引物和模板之間就很難發(fā)生反應(yīng).引物容易自身進(jìn)行反應(yīng)形成二聚體.這樣就有來了個 booster pcr 我一直找不到合適的詞來翻譯這個booster.具體是這樣的.開始幾個cycles保持primer的低濃度,保證primer:template的 molar ratio在107~ 108.以確保開始擴(kuò)增的準(zhǔn)確性.然后booste primer的濃度到正常的水平8.循環(huán)數(shù)和長度

確定循環(huán)數(shù)的基本原理是: 產(chǎn)物能夠保證你進(jìn)一步分析操作的最小循環(huán)數(shù).因為過多的循環(huán)數(shù)容易造 成errors和非特異性產(chǎn)物的積累、產(chǎn)物的量不夠, 優(yōu)化的方法有: 1.增加template 2.增加循環(huán)數(shù)

如何確定循環(huán)數(shù),有一個方法.做一個pcr體系,40循環(huán),50ul, 分別在20,25,30,35循環(huán)時從體系中取5ul,一起跑電泳分析.從而確定最佳的循環(huán)數(shù)另一個會影響pcr特異性的是pcr cycling時在兩個溫度間變化的速率(ramping rate).當(dāng)然是越高越好.不過咱們大部分條件有限,就那么幾臺pcr儀,也沒有多少挑選的余地

l cycler

pcr儀的因素我們經(jīng)常容易忽視.長時間的使用后需要調(diào)整pcr儀,以保證其能夠到達(dá)正確的溫度.現(xiàn)在的pcr儀基本上都有自檢功能(self-diagnosis). additives

附加物或者說enhancer實在是多種多樣.基本上包括幾類, 能夠增加反應(yīng)退火效率的化學(xué)因子, dna結(jié)合蛋白和一些商業(yè)試劑.基本的原理不外是增加引物退火特異性,減少錯配, 增加產(chǎn)物的長度和產(chǎn)量.在gc rich情況中, additive可以造成配對堿基間的的不穩(wěn)定,從而提高擴(kuò)增的效率.而在另一種情況下,additive由于造成錯配的primer-template 復(fù)合物的極大的不穩(wěn)定, 而提高了擴(kuò)增的忠實性.要注意的是,沒有萬能的enhancer全部通用,需要你根據(jù)自己的情況,最好結(jié)合gradient pcr選擇最優(yōu)條件.====== dimethyl sulfoxide(dmso)up to 10% formamide at 5% trimethylammonium chloride 10-100um detergents such as tween 20 0.1-2.5% polyethylene glycol(peg)6000 5-15% glycerol 10-15% single stranded dna binding proteins gene 32 protein 1nm single-stranded dna binding protein 5um 7 deaza-dgtp(for gc rich)150um with 50um dgtp taq extehder(stratagene)perfect match pcr enhancer(stratagene)q-solution(qiagen)====== 要注意的是,dmso,glycerol等會抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最適的濃度

te dna preparation

提取dna時的試劑會抑制pcr反應(yīng)的順利進(jìn)行.因此需要對template dna進(jìn)行純化.特別是sds(<0.01%)的情況下就能強(qiáng)烈抑制pcr的進(jìn)行.可以加入一些nonionic試劑,如tween, nonid, trition之類的反過來抑制sds.還有proteinase k也要除干凈, pcr

簡單點說 設(shè)計兩對引物, 一對是長的, 一對是包含在長引物內(nèi)的, 用長引物擴(kuò)增的產(chǎn)物作為第二次擴(kuò)增的模板,這樣可以增加產(chǎn)物的量.而且可以減少非特異性帶和錯配的情況.增加pcr的保真性 高保真酶

高溫dna polymerase是以單鏈dna或rna為模板，在dntp和一些陽離子的存在情況下，在特定的引物指導(dǎo)下按3'-5'方向合成dna.包括3種類型：

a.5'-3'方向的dna合成能力,沒有3'-5'方向的外切酶特性.如taq及其突變體.這類酶的合成能力強(qiáng),因為他不糾正合成中出現(xiàn)的突變

b.與a類似,有合成活性,沒有3-5的外切活性.但他們能以rna為模板,合成dna.如tth dna polymerase c.有dna聚合活性,沒有逆轉(zhuǎn)錄活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu dna polymerase.可以提高忠實性。但是這些聚合酶的產(chǎn)量比taq dna聚合酶低。酶的混合物

將taq dna聚合酶同帶有3'到5'外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨taq dna聚合酶高的忠實性，并可以得到高產(chǎn)量及擴(kuò)增長模板。其他因素

除了酶，高濃度的dntp或鎂離子會降低忠實性。將dntp的濃度從200μm降低到25-50μm可以增加精確度如果四種核苷的濃度不同，忠實性會受影響。進(jìn)行較少的pcr循環(huán)也會有助于增加忠實性，因為增加循環(huán)數(shù)目和產(chǎn)物長度就會增加突變可能性。

pcr室年終總結(jié)篇三

pcr經(jīng)驗總結(jié)

實驗注意事項：

（1）dna處理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有緩沖液吸頭、離心管等用前必須高溫高壓處理，常規(guī)消耗用品用后作一次性處理，避免反復(fù)使用造成污染。

（2）pcr操作應(yīng)戴手套并勤于更換，必要時應(yīng)戴好帽子和口罩，就像做手術(shù)一樣，要有“無菌觀念”。

（3）成套試劑，小量分裝，專一保存，防止它用。配制試劑用新器具，用后作一次性處理。（4）試劑管用前先瞬時離心（10s），使液體沉于管底，減少污染手套與加樣器機(jī)會。（5）最后加模板dna，馬上蓋好，混勻，瞬時離心（10s），使水相與有機(jī)相分開。加入模板且忌噴霧污染，所有非即用管都應(yīng)蓋嚴(yán)。加模板dna后應(yīng)更換手套。（6）實驗設(shè)陽性、陰性對照。

還有諸如：移液槍用完要放到最大計量位置，防止久了彈簧失靈；防止rna酶污染標(biāo)本；低溫下操作，防降解；試劑有致癌致畸作用，做好個人防護(hù)；頭腦中各操作步驟要清楚，不要加錯試劑。

問題及解決方案匯總：

一、假陰性，擴(kuò)增無條帶

pcr反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及活性 ④pcr循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加taq酶或溴乙錠。

引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是pcr失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看od值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做pcr有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。

mg2+濃度：mg2+離子濃度對pcr擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低pcr擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響pcr擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使pcr擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行pcr擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行pcr擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對pcr擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低pcr擴(kuò)增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是pcr失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其pcr擴(kuò)增是不會成功的。

二、假陽性

出現(xiàn)的pcr擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行pcr擴(kuò)增時，擴(kuò)增出的pcr產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出pcr產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式pcr來減輕或消除。

三、出現(xiàn)非特異擴(kuò)增帶

pcr擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及pcr循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有：①必要時重新設(shè)計引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用兩步法。

四、出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

pcr擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dntp濃度過高，mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dntp的濃度。③適當(dāng)降低mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

五、出現(xiàn)大量引物二聚體

1.從引物自身著手，重新設(shè)計引物，這是最根本解決這一問題的辦法； 2.可能模板有問題；

3.模板濃度過小，適當(dāng)加大模板量；

酶，引物，mg2+濃度可能過高，可降低它們的濃度；

5.取你所要加的上下游引物混合后，在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘，然后迅速拿出置于冰上瞬時冷卻，這時再加入反應(yīng)體系當(dāng)中，引物二聚體就會消失的；

6.所配mix中加5%的甘油或者5%的dmso，可以增強(qiáng)特異性；

反應(yīng)體系的配制在冰上進(jìn)行，最后加taq酶，pcr結(jié)束后，產(chǎn)物勿放置在室溫下過長時間，有人認(rèn)為室溫下有些taq酶會將多余的引物合成為二聚體。

8.增加循環(huán)數(shù)；

9.降低退火溫度后有條帶，則應(yīng)逐漸提高溫度，若提高溫度的同時產(chǎn)物量減少，則考慮增加鎂離子濃度（根據(jù)擴(kuò)增片斷長度而定，片段長則相應(yīng)鎂離子濃度應(yīng)該高一些）；

10.若降低退火溫度，發(fā)現(xiàn)還是只有引物二聚體，而且鎂離子的濃度在20-25mm沒有區(qū)別，則考慮buffer等試劑沒有完全融解、混勻，導(dǎo)致吸取的試劑濃度不對。11.以上次的pcr產(chǎn)物作模板二次pcr，可以提高引物與模板的特異性，減少引物二聚體，如果兩次時間間隔短的話，可以把原產(chǎn)物稀釋100－1000倍，如果間隔較長可以稀釋50－100倍；

六、高gc與復(fù)雜結(jié)構(gòu)的模板處理

將模板置于95℃水浴鍋中處理10分鐘以上，然后置于冰上瞬時冷卻，可大大降低二級結(jié)構(gòu)對pcr的影響。

七、長片段與短片段拼接失?。ǘc突變）

在做定點突變時，倘若突變位點距離基因的某一側(cè)較近（短片段<200bp）時，通常拼接困難或者難以通過電泳結(jié)果直觀判斷是否拼接成功。此時，可在短片段的上方（突變近5’端）或下方（突變近3’端）選取一條載體通用引物與基因另一條引物pcr（控制產(chǎn)物大小>300bp），然后再做基因拼接。確認(rèn)大小無誤后，再以此產(chǎn)物為模板，用基因首尾引物pcr即可。

八、long pcr無條帶

對于>5kb片段擴(kuò)增，常規(guī)pcr很難得到較好的條帶，建議①更換更適合于long pcr的聚合酶；②添加pcr enhancer調(diào)整體系；③設(shè)計多對引物分段擴(kuò)增。

pcr增強(qiáng)劑（pcr enhancer）：

常見的添加劑有：dmso，甘油，甲酰胺，硫酸銨，甜菜堿，bsa等，它們對pcr反應(yīng)的影響雖然有所不同，但都可提高pcr的擴(kuò)增效率。

：解除模板dna局部二級結(jié)構(gòu)，增加引物與模板的特異性結(jié)合，使聚合酶更容易在二級結(jié)構(gòu)處延伸，但是對酶活有抑制作用，且當(dāng)其濃度大于10％時還會降低保真性。

2.甘油：可降低模板溶解溫度（tm），提高產(chǎn)量，但是對酶活有抑制作用。3.甲酰胺：促進(jìn)某些“引物－模板”退火，降低帶有二級結(jié)構(gòu)的dna的變性溫度。4.硫酸銨：增加反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度，改變dna的變性及退火溫度，調(diào)節(jié)酶活。5.甜菜堿：有利于dna雙鏈的解開，polymerase的結(jié)合，提高pcr的效率。

pcr室年終總結(jié)篇四

簡介

pcr實驗室又叫基因擴(kuò)增實驗室。pcr是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction)的簡稱。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的dna片段，可看作生物體外的特殊dna復(fù)制。通過dna基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達(dá)納米級別，精確檢測乙肝病毒在患者體內(nèi)存在的數(shù)量、是否復(fù)制、是否傳染、傳染性有多強(qiáng)、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據(jù)

條件

1、必須擁有標(biāo)準(zhǔn)的的pcr熒光實驗室;實時熒光定量pcr技術(shù)于1996年由美國applied biosystems公司推出 由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了pcr從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)pcr相比，它 有特異性更強(qiáng)、有效解決pcr污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣 泛應(yīng)用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹

2、檢測設(shè)備必須符合標(biāo)準(zhǔn)pcr熒光實驗室設(shè)置要求;熒光定量pcr儀+實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構(gòu)成pcr-dna/rna實時熒光定量檢測系統(tǒng)。

3、必須通過國家臨床檢驗中心的驗收和認(rèn)證;

4、檢測人員必須通過國家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書;pcr實驗室內(nèi)工作人員必須參加由國家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗中心舉辦的臨床基因擴(kuò)增培訓(xùn)班，并持證上崗。pcr實驗室通過驗收，實驗室至少必須應(yīng)有兩個以上持有“臨床基因檢測上崗證”。pcr實驗室必須建立嚴(yán)格的實驗室管理制度、建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序（sop）、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實驗室日常運行符合國家衛(wèi)生部的要求，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確、確保實驗室衛(wèi)生安全，確保實驗室長期穩(wěn)定運行

5、必須在無菌無塵環(huán)境下進(jìn)行操作

功能

能夠?qū)颊卟∏檫M(jìn)行科學(xué)、準(zhǔn)確、實時的掌控，并結(jié)合抗hbv與t細(xì)胞免疫來打破免疫耐受，阻斷肝病病毒復(fù)制的療法、有效的分解肝炎病毒，解決了乙肝病毒易變異、耐藥，病毒復(fù)制模板難以治療，人體免疫耐受狀態(tài)不易打破等醫(yī)學(xué)難題，能迅速消除臨床癥狀，而且有效抑制乙肝病毒復(fù)制，明顯加快e抗原、抗體的血清轉(zhuǎn)換速度，殺滅血液及肝細(xì)胞內(nèi)的病毒，為防止再感染提供了長期保護(hù)，有效阻斷和逆轉(zhuǎn)肝纖維化、肝硬化進(jìn)程。

建立方法

1、建立樣品準(zhǔn)備區(qū)

這個區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準(zhǔn)備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應(yīng)該采取預(yù)防措施：⑴pcr產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的dna克隆不能在這個房間操作。⑵組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取dna或rna。⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。⑷dna樣品應(yīng)該用有專門的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。⑸大體積樣品應(yīng)該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。⑹管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開，這樣會產(chǎn)生氣溶膠。⑺任何時候都應(yīng)該穿實驗服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗。

2、樣品準(zhǔn)備和rna-pcr rna-pcr的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機(jī)會。為了避免這一問題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。在rna-pcr中應(yīng)用ung以防止污染的方法也有報道。

3、建立前pcr區(qū)。

該去專門用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染。前pcr區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專門用于前pcr區(qū)的正壓活塞式移液管。

4、pcr實驗室試劑的操作。

⑴所用的所有溶液都應(yīng)該沒有核酸和（或）核酸酶（dnase和rnase）污染。⑵所有pcr試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。⑶在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴(kuò)增反應(yīng)。⑷所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。⑸所有試劑和樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。⑹新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗。⑺樣品準(zhǔn)備和前pcr區(qū)所使用的移液管在不使用時都應(yīng)該小心保存。

5、在前pcr區(qū)建立pcr混合物。

⑴可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用。⑵如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟(jì)，可以考慮分裝保存夠一天的pcr成分。⑶作為一個規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽性和強(qiáng)陽性對照樣品來分析樣品配制和pcr前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴(kuò)增抑制物。⑷陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在pcr產(chǎn)物的污染，陰性對照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。⑸當(dāng)做陽性對照時，有兩個理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。⑹由于必須有對照反應(yīng)，對照模板的特點應(yīng)該予以考慮。

6、控制污染的方法。

已設(shè)計出很有力的酶學(xué)方法用來消除一種形式的污染—使用ung，這一技術(shù)能有效地消除由pcr產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個數(shù)量級。

7、后pcr區(qū)pcr完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后pcr活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前pcr活動

pcr室年終總結(jié)篇五

高端pcr實驗室控制設(shè)計說明

pcr實驗室即分子生物學(xué)實驗室，在醫(yī)療、科研、生物技術(shù)方面得到廣泛的應(yīng)用。因其在不同行業(yè)的應(yīng)用各有區(qū)別，在具體設(shè)計時也有不同之處，就醫(yī)療機(jī)構(gòu)的應(yīng)用而言，主要使用三區(qū)或四區(qū)設(shè)計，即試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品提取區(qū)、擴(kuò)增分析區(qū)；此類三區(qū)設(shè)計時候應(yīng)用于類似熒光定量型或同類pcr分析設(shè)備，及擴(kuò)增與分析過程在設(shè)備內(nèi)一次完成。而四區(qū)設(shè)計在三區(qū)的基礎(chǔ)上講擴(kuò)增分析區(qū)拆分為擴(kuò)增區(qū)與分析區(qū)適用于其他類型的pcr設(shè)備及手工處理。

在pcr實驗的設(shè)計上，經(jīng)過多年的經(jīng)驗累積，已經(jīng)在一些關(guān)鍵技術(shù)上達(dá)成了共識。因為pcr實驗中所產(chǎn)生的dna與rna片段過于微小，以至于可以穿透高效過濾器，所以在實驗室設(shè)計上已經(jīng)不在強(qiáng)制要求設(shè)計高效凈化系統(tǒng)，但是為了提高實驗環(huán)境水平及保護(hù)實驗室內(nèi)的敖貴設(shè)備方面，如果在具備條件的情況下可考慮追加高效空氣凈化系統(tǒng)；建議凈化級別萬級。在pcr實驗中所產(chǎn)生的dna與rna片段污染是一直以來pcr實驗的重點問題。此類污染主要至上次試驗中所產(chǎn)生的基因片段對下次試驗產(chǎn)生的污染，而且一旦試驗環(huán)境中的污染形成后很難處理。因為消毒等傳統(tǒng)方式對于基因污染沒有很良好的效果。所以在pcr實驗室設(shè)計中一般將整套實驗室設(shè)計為全新風(fēng)型實驗室，這樣而已通過有效的換氣次數(shù)來達(dá)到凈化室內(nèi)污染的作用。而在控制方面也有很多不同之處，因為各單位對pcr實驗的重視程度各有不同，所以在設(shè)計上也有不同，主要的控制設(shè)計有定送定排式壓力控制系統(tǒng)、變送定排式壓力控制系統(tǒng)變送變排式壓力控制系統(tǒng)。在控制設(shè)備方面也有很多區(qū)分如壓力無關(guān)型控制系統(tǒng)、壓力有關(guān)型控制系統(tǒng)。

根據(jù)業(yè)主要求，本pcr實驗室為三區(qū)設(shè)計，各區(qū)可獨立使用，不設(shè)置高效過濾系統(tǒng)等相關(guān)要求，根據(jù)業(yè)主以上要求，我方給出的設(shè)計方案為壓力無關(guān)型變送變排壓力控制系統(tǒng)。本系統(tǒng)的特點是，設(shè)備啟動后可根據(jù)實驗室內(nèi)使用節(jié)點調(diào)節(jié)送風(fēng)量及排風(fēng)量來控制各房間狀態(tài)，系統(tǒng)說明見下圖

? 每個房間可分別控制，使用時通過房間開關(guān)輸出啟動信號，當(dāng)設(shè)備接到啟動信號時設(shè)備運行，運行中根據(jù)管道壓力反饋決定變頻器大小，房間內(nèi)送排風(fēng)量由壓力無關(guān)型風(fēng)量調(diào)節(jié)閥控制。? 當(dāng)有多個房間開啟或關(guān)閉時，設(shè)備更加管道壓力反饋，調(diào)節(jié)設(shè)備變頻器增加或減少送排風(fēng)量來穩(wěn)定管道壓力。各房間內(nèi)壓力又房間內(nèi)的壓力無關(guān)型定風(fēng)量閥進(jìn)行控制。

? 當(dāng)bsc（生物安全柜，b2全排）開啟時bsc專用供風(fēng)機(jī)組運行，bsc-供風(fēng)機(jī)-排風(fēng)機(jī)連鎖運轉(zhuǎn)。

? 當(dāng)bsc做變風(fēng)量調(diào)節(jié)時，根據(jù)房間內(nèi)壓力變化，bsc專用供風(fēng)機(jī)組前安裝的壓力無關(guān)型變風(fēng)量調(diào)節(jié)閥根據(jù)壓力變化增減送風(fēng)量，確保房間壓力執(zhí)行在可控范圍內(nèi)。

? 當(dāng)房間不適用時，房間與緩沖間均關(guān)閉電動密閉閥，確保房間處在密閉狀態(tài)避免布朗運動造成的可能污染風(fēng)險。

? 房間換氣次數(shù)均按照一定凈化標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計，當(dāng)室內(nèi)污染發(fā)生時，通過一定時間的換氣處理后，污染問題可以基本解決。? 本系統(tǒng)如果業(yè)主需要，可在室內(nèi)送風(fēng)口末端加裝高效過濾設(shè)備，房間可升級為凈化型實驗室。

? 壓力無關(guān)型風(fēng)閥簡介：壓力無關(guān)型風(fēng)閥的特點是不會根據(jù)管道壓力的變化而影響風(fēng)閥內(nèi)部的送風(fēng)量，在一定管道壓力區(qū)間內(nèi)能夠自行調(diào)節(jié)閥體阻力，來穩(wěn)定送風(fēng)量，是高端實驗室必備的關(guān)鍵部件，目前此類閥體技術(shù)均有國外生產(chǎn)廠家控制，目前國內(nèi)主用使用的產(chǎn)品有妥思、文丘里、西門子等品牌。